Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single cell sequencing
参与成员：
熊逸 廖凯 王海涛 郑东旭 袁也 余超然 贾敏
摘要
在14个未经过治疗的非小细胞肺癌患者（NSCLC）中，对T细胞进行深度单细胞测序。
发现效应T细胞组织间迁移的特征
发现耗竭前pre-exhausted与耗竭T细胞比值越大，患者预后越好。
Treg细胞的异质性，按照TNFRSF9表达量呈二项分布
开发的网页工具
http://lung.cancer-pku.cn
方法
Monocle：R包，进行单细胞发育过程分析
Cibersort: 进行免疫细胞的定量
Figure认领：
Fig 1 by 熊逸
a. 实验设计的流程。获取患者的血液，肿瘤组织与癌旁组织标本。进行流式细胞仪FACS分选，接着进行单细胞转录组测序。对TCR和转录组进行测序。
b. tSNE. 鉴别出T细胞的16个亚群。xy轴代表tSNE的维度1和维度2。tSNE是单细胞转录组测序进行分群展示的常规结果图。作图的显示利用tSNE降维，在对降维结果进行注释，用不同的颜色表示。每一个点代表一个细胞，每一个颜色代表一个细胞亚群。
c. 热图。表示在不同的细胞亚群中，不同功能基因集中的基因表达量差异。作者特异将差异明显的特征基因标注了出来。很好奇这里是如何得到这基因集的？
d. 不同亚群组织分布的偏好性。那就是比数量。但是来源于normal, tumor, blood tissue里边的细胞数显然不同，在取样的时候就不一致。所以这个地方一定要对取样误差进行校正。这里定义为Ro/E，使用Chi-square进行校正。大于1的代表富集。不同组见的比较使用Paired student’s T-test。
Fig 2 by 熊逸
T细胞受体（TCR）的分析。
a. 描述性。分析某种克隆类型的细胞数与T细胞克隆数量的关系。LOESS进行拟合。得到一个反比的关系。
b. 对CD8+T细胞TCR进行聚类，分为4类组织间，血液内，正常组织内，肿瘤组织内。
c. 条形图。描述不同病人中不同细胞亚群的比例。
d.不同组织间共有克隆细胞的比较。
e.接着解释d中共有的几个亚类，进行KEGG分析，进行这几个亚类的通路富集分析。发现了可能的机制：这些共有的细胞亚类来源于血液和组织。
Fig 3 by 熊逸
进行CD8+细胞的分析
重点：利用monocle, bc分析出不同CD8克隆的细胞之间的发育关系，功能关系。
与预后的关系
e: 利用Cibersort分析TCGA数据，根据CD8-C5-ZNF683和 CD8-C6-LAYN表达量进行分组。CD8-C4-GZMK 和CD8-C5-ZNF683代表pre-exhausted状态。CD8-C6-LAYN反映exhausted状态。CD8-C5-ZNF683/CD8-C6-LAYN值更低的患者预后较差。这个是可以理解的，已经消耗的细胞越多，患者预后越差。
Fig 4 by 廖凯
Figure4活化的肿瘤Treg的存在和T细胞异质性在NSCLC中的临床意义。
a. 作者选用TNFRSF9（一种已知的抗原特异性Tregs活化标记物）对CD4-C9-CTLA4细胞进行筛选，展现出双峰分布（红色表示高密度，黄色表示低密度），表明在静止的肿瘤组织中Tregs部分被激活。
b. 根据肿瘤中TNFRSF9阴性(n=420)与阳性差异（n=519）进行差异基因表达分析，筛选条件：P<0.01，FC≥2（limma包的双侧t-检验），绘制火山图，每个红点表示个体基因。
c. 根据TCGA LUAD数据，按活化肿瘤Treg的260个基因特征分为高低两组，绘制Kaplan-Meier总生存曲线，通过多变量Cox回归计算P值（P=0.0005）
d. 绘制九个富含肿瘤的细胞亚群中每一个的特征基因的平均表达的热图。 用CIBERSORT分别估计的CD8 + / CD4 + T细胞级分标准化CD8 / CD4簇的特征基因的平均表达水平。 每列代表患者并通过z评分标准化以指示T细胞的相对组成。 根据9个亚组的模式，通过层次聚类将患者聚类成两组
e. 根据9,055个单T细胞中PDCD1，CTLA4，LAG3和CD27的表达水平绘制t-SNE散点图
f. 根据目前免疫疗法靶向的基因在不同细胞亚群中表达结果绘制热图。 颜色密度表示给定基因的平均表达，每行通过z-score标准化。
